张家庆¹，王璟¹，陈俊峰¹，任巧玲¹,高彬文¹，马强¹，郭红霞¹，白献晓¹，熊少伟²，梁永红¹，邢宝松[1]^*  

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；2. 河南兴锐农牧科技有限公司,河南 信阳 465550）

摘要：为更有效地保护和高效利用现有地方良种资源，充分挖掘其优异基因为育种和生产服务，对现有淮南猪种质资源进行亲缘关系研究具有重要的理论和实际意义。本研究利用微卫星标记技术，采用国际动物遗传学会( ISAG) 和联合国粮农组织( FAO) 共同推荐的21个微卫星标记，对现有淮南公猪的基因组DNA进行了检测，通过计算等位基因数量、基因频率、亲缘关系、遗传距离等参数，对其遗传多样性的现状进行了初步分析。结果表明：在 21个微卫星基因座上共检测到 93个等位基因，21个位点的等位基因数为3-8个，平均等位基因数为4.43个；公猪个体间的亲缘关系清晰可见，在系数为0.748水平上可聚为7类。结论：通过本研究明确了现有淮南猪良种资源的亲缘关系，为有效保护和高效开发利用提供了分子生物学依据。

关键词：淮南猪；微卫星标记；亲缘关系；遗传多样性；

    淮南猪，又名淮南黑猪、历史悠久，是河南省著名的地方优良品种之一，也是“我国少有的地方优良品种之一”，属华北类型，具有性成熟早，耐粗饲、适应性强、遗传性能稳定、肉质鲜嫩，色泽鲜艳等优良特性^[1]。淮南猪主要产区位于河南省东南部，2004年新县通过了国家淮南猪原产地标记注册。近年来，由于受到一些外来品种的影响和盲目杂交，纯种淮南猪饲养量逐年减少，品种纯度及遗传多样性在一定程度上受到威胁。因此，对淮南猪遗传多样性进行研究，评估其遗传多样性现状, 并据此及时采取有效措施，对于保护和高效利用淮南猪资源具有重要的意义和实际意义。微卫星DNA 标记技术是一种已发展成熟的分子生物学研究工具，与其它分子标记技术，如RFLP、RAI D、SNP等相比较，该技术具有很多优越性，如广泛分布于各种真核生物基因组中并呈随机分布，呈共显性遗传并遵循孟德尔遗传规律，具有丰富的多态性，相对保守性，容易检测，受内外环境因素影响小，遗传稳定等，是目前应用较为广泛的一种DNA分子标记^{[2, 3]}。本研究利用微卫星标记技术，对目前淮南猪繁育群体基因组DNA 的多态性进行比较分析，研究遗传多样性的现状，明确其遗传结构和亲缘关系，为有效保护和高效开发利用河南省现有地方优良猪种资源提供理论参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集 试验用淮南猪（公，24头）来自新县境内不同繁育种群。采用5mL一次性真空血液采集管 (EDTA抗凝)，前腔静脉采血，每头5mL左右，血样冷藏运回实验室，-20℃冷冻保存。

1.1.2仪器设备

常压电泳仪、4℃、－20℃冰箱、低温高速离心机、水浴锅、分析天平、pH计、PCR仪等。

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA提取  采用基因组DNA快速提取试剂盒（天根生物科技有限公司）从血液样品中快速提取DNA，具体操作方法参照试剂盒说明书。

1.2.2微卫星标记位点   利用21个分布于猪主要染色体上的微卫星位点检测取样公猪的遗传多样性，各微卫星位点的染色体位置、等位基因数、引物序列及荧光标记、Tm值见表1。

1.2.3  PCR扩增的体系   采用 10 μL 反应体系，具体反应程序: 94℃预变性5min，30循环（95℃ 30s; 退火30s; 72℃1min），72℃终末延伸5min。

1.2.4 PCR产物的检测  采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效率，银染法显色、拍照保存。

1.2.5数据统计分析                 

利用Cervus软件分析微卫星各位点的等位基因频率；应用NTSYSpc2.1 遗传分析软件对21对引物进行分析，获得遗传相似系数，根据相似系数UPGMA 法对试验动物进行了聚类分析。

表1　微卫星位点的染色体位置、等位基因数及引物序列

Table1 Microsatellite loci in the chromosome location, the number of alleles and primer sequences

座位 Loci	染色体 Chormosome	等位基因大小（bp） Allele size	引物序列(5’- 3’) The sequence of primers	退火温度/℃ Annealing temperature
S0155	1q	150-166	TGTTCTCTGTTTCTCCTCTGTTTG GTTAAAGTGGAAAGAGTCAATGGCTAT	55
CGA	1q	250-320	ATAGACATTATGTAAGTTGCTGAT GAACTTTCACATCCCTAAGGTCGT	55
SW240	2P	96-115	AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA	55
SW72	3P	100-116	ATCAGAACAGTGCGCCGT GTTTGAAAATGGGGTGTTTCC	55
SW902	3q	195-214	ATCAGTTGGAAATGATGGCC CTTGCCTCAAAGAGTTGTAAGG	55
S0227	4P	231-256	GATCCATTTATAATTTTAGCACAAAGT GCATGGTGTGATGCTATGTCAAGC	55
S0005	5q	205-248	TCCTTCCCTCCTGGTAACTA GCACTTCCTGATTCTGGGTA	55
S0228	6q	222-249	GGCATAGGCTGGCAGCAACA GTTCCGCCCTCACAGACCCAAAT	55
S0101	7q	197-216	GAATGCAAAGAGTTCAGTGTAGG GTCTCCCTCACACTTACCGCAG	55
S0225	8	170-196	GCTAATGCCAGAGAAATGCAGA CAGGTGGAAAGAATGGAATGAA	55
SW911	9p	153-177	CTCAGTTCTTTGGGACTGAACC CATCTGTGGAAAAAAAAAGCC	55
SW951	10q	125-133	TTTCACAACTCTGGCACCAG GATCGTGCCCAAATGGAC	55
S0386	11q	156-174	GAACTCCTGGGTCTTATTTTCTA GTCAAAAATCTTTTTATCTCCAACAGTAT	55
S0090	12q	244-251	CCAAGACTGCCTTGTAGGTGAATA GCTATCAAGTATTGTACCATTAGG	55
SW769	13	106-140	GGTATGACCAAAAGTCCTGGG TCTGCTATGTGGGAAGAATGC	55
SW857	14	144-160	TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC GATCCTCCTCCAAATCCCAT	55
S0355	15	243-277	TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATG GTTTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGA	55
SW742	16	193-224	AATTCTACTTCTGGGGAGAGGG CTTTTGGGAACATTTCTGCC	55
SW24	17	96-121	CTTTGGGTGGAGTGTGTGC ATCCAAATGCTGCAAGCG	55
SW1023	18	84-117	AACCTGCTGAGCCACAGTG GCAAGTACCCAATCTTTTTTCC	53
S0218	X	164-184	GTGTAGGCTGGCGGTTGT CCCTGAACCCTAAAGCAAAG	55

 

2 结果与分析

2.1微卫星引物扩增结果

利用21对微卫星引物对淮南猪基因组DNA 模板进行了PCR扩增；部分微卫星座位PCR 扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果见图1。从凝胶电泳图谱我们可以看出，所测位点的多态性较好，条带清晰易辩，杂带少，说明所提DNA质量高，扩增和染色时间掌控好。21个微卫星座位的等位基因大小、染色体位置、等位基因数、引物序列等见表 1。

 

图1  淮南公猪PCR扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

Fig1 Polyacrylamide gel electrophoresis results of genomic DNA of Huainan boars

 

2.2淮南猪群体遗传变异

24头淮南公猪个体中共检测到93个等位基因，21个微卫星座位各等位基因大小、基因频率见表2。

表 2  各个位点等位基因大小及基因频率

Table 2 Gene frequency and the size of all loci alleles

 

2.3淮南猪个体间亲缘关系

运用NT system对24头淮南公猪个体间的亲缘关系进行了聚类分析，分享结果见图2。根据图2可以将淮南公猪划分7个类型：XHN-3、XNH-3、XHN-29、8M-2聚为一类；XHN-4、XHN-11、XHN-6、XHN-10、XHN-7、XHN-19、XHN-26、XHN-30、XHN-17、XHN-23聚为一类；XHN-13、XHN-20、XHN-28、XHN-31聚为一类；XHN-14、XHN-22聚为一类；XHN-21单独聚为一类；XHN-24、SN-29聚为一类；XHN-32单独聚为一类。

图2 淮南公猪个体间聚类结果

Fig 2 Clustering result for the individuals of Huainan boars

3 讨论

在加快淮南猪高效开发与利用过程的任何阶段中，其选种选配都要结合个体间的亲缘关系，根据本研究结果可初步确定被检公猪之间的个体亲缘关系、遗传结构等，本研究为进一步加快高效开发与利用地方良种资源提供了有效的理论依据。

微卫星又称为短串联重复序列或简单重复序列，是均匀分布与真核生物基因组中的序列，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，微卫星标记的应用非常广泛应用^[4-6]。不同个体在同一微卫星座位上的等位基因数目和频率的差异能够体现出其遗传上的差异, 并可借此来确定个体间的亲缘关系和遗传结构^{[7, 8]}。在微卫星应用研究中，Zeveren等运用微卫星7个座位对比利时4个猪种进行了研究，通过多肽信息含量、有效等位基因数、等位基因频率等分析了各个品种遗传多样性^[9]。Li等利用微卫星20个座位对我国10个地方种猪进行了遗传多样性分析^[10]。SanCristobal等^[11]利用微卫星标记对欧洲猪种进行了遗传多样性分析。众多研究表明，在世界各地的猪群中都有较好的多态性，其中14个微卫星位点：S0155、SW240、SW72、S0227、S0005、S0228、S0101、S0355、SW911、SW951、S0386、S0090、SW769、SW857、SW24，已被用来进行奥地利猪群（长白、皮特兰和大白猪）的亲缘关系鉴定，结果的可靠性在99%以上^[12]。本研究采用了21个微卫星标记，检测了不同来源且具有代表性的不同淮南公猪个体间在DNA 水平上的变异，并估测了不同个体间的遗传距离，因此本研究具有很高的可信度，更能准确地反应其当前遗传多样性的现状。

淮南猪具有耐寒、耐热、耐粗饲、抗病性能好、肉质性状优异，曾是地方农民饲养的当家猪种。自20世纪80代末以来，随着外来瘦肉型猪种的大量引进，尤其是外来公猪不断被引进，由于盲目杂交导致纯种淮南猪饲养量急速下降。本试验通过检测现有淮南公猪卫星位点的基因,初步分析被检测个体之间的亲缘关系和群体遗传结构，这为有效地保护和利用现有地方良种资源，挖掘优异基因为育种工作和生产服务提供了有效的分子水平的理论依据。

 

参考文献:

 

[1] 王清义. 淮南猪种质特性的研究与应用[D]. 北京：中国农业大学，2005.

[2] 樊斌. 地方猪遗传多样性的微卫星DNA标记检测与评估方法研究[D].武汉：华中农业大学, 2003.

[3] 吴云良，包文斌，张红霞, 等. 微卫星技术分析东北虎遗传多样性及亲缘关系[J]. 扬州大学学报:农业与生命科学版, 2011, (01): 87-91.

[4]  Yang L，Zhao S H，Li K，et al. Determination of genetic relationships among five indigenous Chinese goat breeds with six microsatellite markers [J]. Animal Genetics, 1999, 30 (6): 452-455.

[5]    Martınez A M, Delgado J V, Rodero A, et al. Genetic structure of the Iberian pig breed using microsatellites [J]. Animal Genetics, 2000, 31: 295-301.

[6]  Kim TH, Kim K S, Choi B H, et al. Genetic structure of pig breeds from Korea and China using microsatellite loci analysis[J]. Journal of animal science, 2005, 83 (10): 2255-2263.

[7] 樊斌,李奎，彭中镇，等.湖北省三品种猪27个微卫星座位的遗传变异[J]. 生物多样性, 1999, (02): 11-16.

[8] 张涛, 路宏朝,李新生. 微卫星进化属性及其功能的研究进展[J]. 中国农学通报, 2010, (01): 44-47.

[9] Zeveren A Van, Peelman Luc, Weghe, A Van De, et al. A genetic study of four Belgian pig populations by means of seven microsatellite loci [J]. Journal of Animal Breeding and Genetics, 1995,112(1-6): 191-204.

[10] Li S-J, Yang S-H, Zhao S-H, et al. Genetic diversity analyses of 10 indigenous Chinese pig populations based on 20 microsatellites[J]. Journal of Animal Science, 2004, 82 (2): 368-374.

[11] SanCristobal M, Chevalet C, Haley C S, et al. Genetic diversity within and between European pig breeds using microsatellite markers [J]. Animal Genetics, 2006, 37 (3): 189-198.

[12] Nechtelberger D, Kaltwasser C, Stur, I, et al. DNA microsatellite analysis for parentage control in Austrian pigs [J]. Animal Biotechnology, 2001, 12 (2): 141-144.

 

 

Sudies on Geneitc Relationships among Huainan boars GermPlasm

 

ZHANG Jia-qing¹, WANG Jing¹, CHEN Jun-feng¹, REN Qiao-ling¹, XIONG shao-wei², XING Bao-song1^*

 

 (1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450008, China; 2. Henan Xing Rui agricultural and animal husbandry technology Co., LTD. Xinyang 465550, China )

 

Abstract: It is of great theoretical and practical significance to study the genetic relationships among Huainan pigs for potentializing gene resources and serving the bereding. In this study, the genetic variability within Huainan boars in Henan Province were surveyed by means of 21 microsatellite loci recommended by ISAG (the International Society for Animal Genetics) and FAO (Food and Agriculture Organization). The number of alleles，allele frequency，genetic relationship，genetic distances and so on among these boars were calculated. Totally 93 alletes were found, and the number were ranged from 3 to 8 for each locus. The average number of alleles was 4.43. The genetic relationship among the individuals was clear. The cluster analysis for  24 boars was carried out with NTSYSpc2.1 software and the 24 boars could be divided into 7 categories at coefficient value of 0.748. In conclusion, this study clarified the genetic relationship among Huainan boars and provided molecular basis for potentializing gene resources and serving the bereding.

Key words: Huainan pig; Microsatellite markers; Genetic relationship; Genetic diversity